目的 通过多队列转录组整合与单细胞分辨率分析筛选肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)稳健相关关键基因,阐明其细胞来源及与免疫微环境重塑的潜在联系,为PAH生物标志物与机制研究提供依据。
方法 分别对3个独立转录组队列(GSE217438、GSE117261、GSE33463)进行PAH与对照差异表达分析并取交集获得跨队列一致候选基因;基于相互作用基因/蛋白质检索工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins, STRING)构建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络定位关键节点;采用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)构建共表达网络并进行模块-性状关联与功能富集;进一步分析肺组织单细胞转录组数据,明确G蛋白信号传导调节因子1(regulator of G- protein signaling 1, RGS1)的细胞来源并在单核-巨噬细胞谱系中开展拟时序分析,同时比较对照与PAH的细胞通讯差异并筛选关键配体-受体轴;最后构建野百合碱(monocrotaline, MCT)(60 mg/kg)诱导大鼠PAH模型,通过肺泡巨噬细胞RT-qPCR、Western blot及肺组织免疫组化验证RGS1表达变化。
结果 三队列差异基因交集提示候选基因具有较强跨队列稳定性,其中免疫调控相关基因RGS1被进一步聚焦;在3个独立队列中,RGS1在PAH组显著上调(P<0.05)。蛋白互作网络结果表明,RGS1位于网络中心位置并与多种G蛋白信号及免疫相关分子相互作用,提示其可能参与GPCR免疫相关通路。WGCNA分析结果显示RGS1所属深灰色模块与PAH表型高度相关(cor=0.43, P=5e-5),该模块基因富集适应性免疫反应、免疫球蛋白介导反应及淋巴细胞介导免疫等通路。单细胞分析显示RGS1主要在免疫细胞中高表达,PAH组巨噬细胞比例显著上升并伴随炎症相关通路富集(P<0.05);拟时序结果表明单核-巨噬细胞沿轨迹发生连续状态迁移,RGS1表达随伪时间动态变化;细胞通讯分析则显示PAH组整体通讯数量和强度增强,并筛选到在PAH组的配体-受体对PPIA-BSG通讯概率升高,提示信号网络重塑。模型组接受野百合碱(monocrotaline, MCT)动物模型中实验组肺泡巨噬细胞RGS1 mRNA与蛋白水平上调(P<0.01),同时肺组织免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)显示RGS1阳性信号增强。
结论 RGS1可能参与PAH免疫微环境重塑,并有望成为免疫相关生物标志物和潜在干预靶点。