目的 探讨人诱导多能干细胞(hiPSCs)来源外泌体(Exo)对肾缺血再灌注损伤(IRI)的影响。
方法 培养hiPSCs,收集上清液超速离心提取外泌体,蛋白质印迹法(WB)检测外泌体特异性标志物(CD9、CD63和CD81)以及阴性指标Calnexin蛋白表达,通过透射电镜观察其形态、纳米粒径分析检测粒径大小,对外泌体进行鉴定。将SD大鼠随机分为假手术组、IRI组、IhiPSCs组和IhiPSCs-Exo组,每组各6只。IRI后48 h行血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)测定及肾组织切片HE染色,并进行改良Paller肾小管损伤评分。实时荧光定量聚合酶链反应测定IL-1β、TNF-α、SOD2和Nrf-2表达,免疫组化测定CD163、CD168、α-SMA、COL-1和FN-1表达,WB测定p-MEK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3、Bcl-2和Bax表达。以人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)为基础设立缺氧/复氧(H/R)组和H/R+hiPSCs-Exo组,CCK-8测定增殖差异,Annexin V-FITC/PI测定凋亡差异,WB测定Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey HSD检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果 外泌体具有双层膜结构,呈典型杯状形态,平均粒径为(88.0±0.6)nm,表达标志蛋白CD9、CD63和CD81。体内实验结果显示,与IRI组比较,IhiPSCs组和ihiPSCs-Exo组Scr、BUN和改良Paller肾小管损伤评分降低,IL-1β、TNF-α水平下降,SOD2、Nrf-2水平升高;免疫组化染色显示,与IRI组比较,IhiPSCs组和IhiPSCs-Exo组CD68、α-SMA、COL-1和FN-1表达量均降低,CD163表达量升高,P-MEK1/2、P-ERK1/2、Caspase-3和Bax蛋白相对表达量均降低,Bcl-2相对表达量升高(P均<0.05)。体外实验显示,与H/R组比较,H/R+hiPSCs-Exo组HK-2细胞增殖能力提高,凋亡细胞和坏死细胞减少,Caspase-3、Bax蛋白表达量下降,Bcl-2表达量升高。
结论 hiPSCs来源外泌体可通过抑制氧化应激、炎症因子表达和凋亡等多种途径,发挥对肾IRI的保护作用,通过抑制MEK/ERK途径改善肾IRI。